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BOD5的测定通常采用标准稀释接种法（HJ 505-2009）。其操作为，经中和及除去毒性物质并经稀释后的水样（必要时加入适量含好氧微生物的接种液）置入培养瓶中，20℃避光培养5天，通过测定培养前后水样中溶解氧的含量，计算出5天内的耗氧量，再根据稀释倍数得到BOD5。 BOD5的测定是生物和化学作用的共同结果，必须严格按照操作规范进行。改变任何一个条件都会影响测定结果的准确性和可比性。影响BOD5测定的条件包括pH值、温度、微生物种类和数量、无机盐含量、溶解氧和稀释倍数等。 用于检测BOD5的水样必须装满并密封在取样瓶中，并储存在2至5°C的冰箱中直至分析。一般应在取样后6小时内进行检验。在任何情况下，水样的保存时间都不应超过 24 小时。 在测量工业废水的BOD5时，由于工业废水通常含有较少的溶解氧，且大部分成分是可生物降解的有机物质，为了保持培养瓶中的好氧状态，必须对水样进行稀释（或接种稀释），这个操作是标准稀释法的比较大的特点。为保证测量结果的可靠性，稀释水样培养5天后耗氧量必须大于2mg/L，残留溶解氧必须大于1mg/L。 放入接种液的目的是保证一定量的微生物降解水中的有机物，接种液的量以使5天耗氧0.1mg/L以下为佳。使用金属蒸馏器制备的蒸馏水作为稀释水时，应注意检查其中金属离子的含量，以免抑制微生物的繁殖和新陈代谢。为保证稀释水中的溶解氧接近饱和，必要时可通入净化空气或纯氧，然后置于20℃培养箱中一定时间，以使与空气中氧分压达到平衡。 稀释倍数的确定以培养第5天耗氧量大于2mg/L，剩余溶解氧大于1mg/L为原则。稀释系数太大或太小都会导致测试失败。而且由于BOD5的分析周期较长，一旦出现类似情况，也无法原封不动地补充。测量某工业废水的BOD5时，可先测量其CODCr，然后参考现有水质相近废水的相关监测数据，初步确定待测水样的BOD5/CODCr值，然后计算BOD5的大致范围，并确定稀释系数。 对于含有抑制或杀灭好氧微生物代谢活动物质的水样，用普通方法直接测定BOD5的结果会与实际值有偏差，测定前必须进行相应的预处理。这些影响BOD5测定的物质和因素包括重金属等有毒无机或有机物质、余氯等氧化性物质，pH值过高或过低等。
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