一般BOD5（五日生化需氧量）常用的是稀释法，选择原样品或经适当稀释的样品进行测定，然后用适当的倍数进行稀释。使培养瓶中有足够的溶解氧以满足五日生化的需氧要求。将满足上述条件的样品分成两份，一份测定当天的溶解氧质量浓度，另一份放入20摄氏度的培养箱内，培养5天后再检测溶解氧的质量浓度。这两种样品的差就是五日生化需氧量。
对于某些污染严重的地面水及大多数工业废水、生活污水,因含较多的有机物,需要稀释后再培养测定,以降低其浓度,保证生物降解过程在有足够溶解氧的条件下进行。其具体水样稀释倍数可借助于高锰酸钾指数或化学需氧量(COD)推算。
对于不含或少含微生物的工业废水,在测定BOD时应进行接种,以引人能分解废水中有机物的微生物。当废水中存在难于被一般生活污水中的微生物以正常速度降解的有机物或含有剧毒物质时,应接种经过驯化的微生物。
稀释法所用仪器和试剂
(1)恒温生物培养箱,20L细口玻璃瓶,1000mL量筒,玻璃搅棒(棒长应比所用量筒高度长20cm,在棒的底端固定一个直径比量筒直径略小,并带有几个小孔的硬橡胶板),200~300mL溶解氧瓶,虹吸管(供分取水样和添加稀释水用)。
(2)磷酸盐缓冲溶液将8.5g磷酸二氢钾KH2PO4,21.75g磷酸氢二钾K2HPO4,3.4g磷酸氢二钠Na2HPO·7H2O和1.7g氯化铵NH4Cl溶于水中,稀释至1000mL。此溶液的pH为7.2。
(3)硫酸镁溶液将22.5g硫酸镁MgSO4·7H2O溶于水中,稀释至1000mL。
(4)氯化钙溶液将27.5g无水氯化钙溶于水,稀释至1000mL。
(5)氯化铁溶液将0.25g氯化铁FeCl3·6H2O溶于水,稀释至1000mL。
(6)稀释水在20L玻璃瓶内装入一定量的蒸馏水,每升蒸馏水中加入氯化钙溶液、氯化铁溶液、硫酸镁溶液、磷酸盐缓冲溶液各1mL,然后用无油空气压缩机或薄膜泵曝气，使水中溶解氧含量达8~9mg/L时,停止曝气,盖严,使溶解氧稳定。

如果工业废水中含有有毒物质,缺乏微生物时,稀释水中应加适量的经沉淀后的生活污水,作为微生物的接种,通常每升稀释水接种2mL沉淀污水;或将驯化后的特种微生物引入水样中进行接种。
(7)测定溶解氧的全部试剂。
稀释法检测水中BOD5的操作步骤
1.稀释水的检验
用虹吸法吸取稀释水(或接种稀释水),注满两个溶解氧瓶,加塞,用水封口。其中一瓶立即测定其溶解氧,另一瓶置于恒温生物培养箱内,在(20±1)℃培养5d后测定。要求溶解氧的减少量小于0.2~0.5mg/L。
2.稀释倍数的确定
地面水可由测得的高锰酸盐指数乘以适当的系数求出稀释倍数。
工业废水可由重铬酸盐法测得的COD值确定。通常需作三个稀释比,即使用稀释水时,由COD值分别乘以系数0.075、0.15、0.225,即获得三个稀释倍数,使用接种稀释水时,则分别乘以0.075、0.15和0.25,获得三个稀释倍数。
如无现成的高锰酸盐指数或COD值资料,一般污染较严重的废水(如工业废水)可稀释成0.1%~1%,对于普通和沉淀过的污水可稀释成1%-5%,生物处理后的出水可稀释成5%~25%,污染的河水可稀释成25%~100%
3.稀释水样的配制和BOD测定总不可残
(1)不需经稀释水样的测定溶解氧含量较高、有机物含量较少的地面水,可不经稀释,而直接以虹吸法将混匀水样转移至两个溶解氧瓶内,转移过程中应注意不使其产生气泡。以同样的操作使两个溶解氧瓶充满水样后溢出少许,加塞水封。然后立即测定其中一瓶的溶解氧。将另一瓶放入培养箱中,在(20±1)℃培养5d后。测其溶解氧。
(2)需经稀释水样的测定
①一般稀释法
按照选定的稀释比例,用虹吸法沿筒壁先引入部分稀释水(或接种稀释水)于1000mL量筒中,加入需要量的均匀水样,再引入稀释水(或接种稀释水)至1000mL,用带胶板的玻璃棒小心上下搅匀。搅拌时勿使搅棒的胶板露出水面,防止产生气泡。
按不经稀释水样的测定步骤,进行装瓶,测定当天溶解氧和培养5d后的溶解氧含量。含水样1%以下的稀释水样通常采用一般稀释法。
②直接稀释法
直接稀释法是在溶解氧瓶内直接稀释。在已知两个容积相同(其差小于1mL)的溶解氧瓶内,用虹吸法加入部分稀释水(或接种稀释水),再加入根据瓶容积和稀释比例计算出的水样量,然后引入稀释水(或接种稀释水)至刚好充满,加塞,勿使气泡留于瓶内。其余操作与上述稀释法相同。
在BOD5测定中,一般采用叠氮化钠修正法测定溶解氧。如遇干扰物质,应根据具体情况采用其他测定法。
最后根据所得数据进行计算处理，不经稀释直接培养的水样可用：BOD5(mg/L)=C1-C2公式计算。经稀释后培养的水样可用：BOD5（mg/L）=(C1-C2)-(B1-B2)f1/f2公式计算。
稀释法检测水中BOD5时需要注意的问题
(1)对于生化处理后的水中常含有硝化细菌,干扰BOD的测定,可加入硝化抑制剂,如丙烯基硫脲C4H3N2S或用酸处理消除干扰。
(2)在两个或三个稀释比的样品中,凡消耗溶解氧大于2mg/L和剩余溶解氧大于1mg/L都有效,计算结果时,应取平均值。
(3)培养过程中应经常检查培养瓶封口的水,及时补充,避免干涸。